Troubleshooting

    Approche générale

    Qui ne le sait pas ?

    Subitement, les résultats chromatographiques sont modifiés. Par exemple, il y a division ou tailing des pics. Peut-être que les temps de rétention ont été décalés, voir qu'aucun pic n'a été détecté.

    Il est alors temps de trouver la cause de l'anomalie et de l’éliminer. Étant donné que le chromatogramme définitif est influencé par divers facteurs, tous les composants et variables possibles doivent être systématiquement examinés.

    Un examen méthodique et ciblé des paramètres suivants est réalisé : Chaque procédure est décrite plus en détail ultérieurement dans le présent document :

     

    Voici votre guide de dépannage YMC (U)HPLC

    Télécharger le guide de dépannage (EN)
    Télécharger le guide de dépannage (DE)

     

    Les problèmes et leurs causes

    1. Changement de contre-pression

    Changement de contre-pression

    Les causes d’un changement de contre-pression sont souvent dues à une erreur de manipulation des échantillons et des solvants, ce qui entraîne un blocage ou une contamination des composants du système et de la colonne.

     

    1.1 Pas de pression ou pression trop basse

    Pas de pression / pression trop basse

    Causes possibles

    		Solutions
    Formation de pression négative dans le contenant de réserve d'éluants
    • Éviter la formation de pression négative dans le contenant de réserve, utiliser des valves de compensation dans le couvercle des flacons d'éluants, préparez des tampons le jour même.
    Défauts d’étanchéité des joints de piston ou des valves de la pompe  
    • Vérifier les joints d’étanchéité et remplacer si nécessaire
    Air ou particules dans la tête de pompe ou les valves de la pompe
    • Rincer la pompe avec de l'eau ou de l'IPA ; Pompez de l'eau ou de l'IPA à l'aide d'une seringue au travers de la pompe qui aura été éteinte
    Fuite dans les conduites de transmission
    • Vérifier les raccords vissés et les capillaires et les remplacer si nécessaire

    Augmentation de la pression / pression trop élevée

    Causes possibles

    		 Solutions

    Obturation de l’injecteur ou des voies capillaires
    • Nettoyer l'injecteur, nettoyer les conduites d'alimentation obturées ou remplacer si nécessaire

    Contamination de l'eau par des algues/bactéries
    • Préparer des tampons le jour même

    Précolonne ou fritté d'entrée de la colonne bloqué(e)
    • Procéder au rétro-rinçage de la colonne (si autorisé)
    • Remplacer la colonne

    Contamination de la phase stationnaire

    • Laver la colonne avec un solvant puissant

    • Consulter les propositions du fabricant pour régénérer la colonne

    • Procéder au rétro-rinçage de la colonne (si autorisé)

    • Remplacer la colonne
    1.2 Fluctuation de la pression

    Pressure Fluctuation

    Causes possibles Solutions

    Défauts d’étanchéité des joints de piston ou des valves de la pompe       
    • Vérifier les joints d’étanchéité et remplacer si nécessaire

    Air ou particules dans la tête de pompe ou les valves de la pompe
    • Rincer la pompe avec de l'eau ou de l'IPA ; Pompez de l'eau ou de l'IPA à l'aide d'une seringue au travers de la pompe qui aura été éteinte, vérifier et remplacer si nécessaire
    2. Régénération de colonne

    Forme et symétrie des pics

    Dans la plupart des cas, le changement de forme des pics est dû à des erreurs systématiques dans les conditions des méthodes, à un choix inadapté de la colonne de séparation ou du solvant, ou au vieillissement normal de la colonne. La cause largement la plus courante est l’utilisation d’un solvant d’injection trop fort ou inadapté, ainsi qu’un volume d’injection trop important.

    Le tableau suivant présente les symptômes typiques ainsi que les causes possibles et les solutions. Les symptômes  surviennent en général en même temps que d'autres problèmes du chromatogramme (par exemple, modification de la pression ou du temps de rétention).

     

    2.1 Élargissement du pic

    Élargissement du pic

    Causes possibles Solutions

    Élargissement du pic
    • Volume d'injection trop important

    Injecter un volume plus petit
    • Taux de détection trop faible

    Temps de rétention trop longs

    • Élution par gradient

    • Utilisation d’un autre solvant présentant une capacité d’élution plus forte

    Viscosité du solvant trop élevée

    • Utilisation d’un autre solvant

    Contamination de la phase stationnaire
    • Augmenter la température de la colonne
    • Laver la colonne avec un solvant puissant
    • Consulter les propositions du fabricant pour régénérer la colonne
    • Procéder au rétro-rinçage de la colonne (si autorisé)
    • Remplacer la colonne

     

    2.2 Fronting ou tailing

    Fronting

    Causes possibles Solutions

    Surcharge de la colonne

    • Réduire le volume d’injection ou la concentration de l’échantillon

    • Utilisation d’une colonne avec un plus grand DI

    • Utilisation d’une phase stationnaire avec une plus grande surface

    Viscosité de l'échantillon ou de la phase mobile trop élevée

    • Augmentation de la température

    • Changement pour une autre phase mobile

    • Réduire le volume d’injection ou la concentration de l’échantillon

    Contamination de la phase stationnaire

    • Laver la colonne avec un solvant puissant

    • Consulter les propositions du fabricant pour régénérer la colonne

    • Procéder au rétro-rinçage de la colonne (si autorisé)

    • Remplacer la colonne

    Tailing

    Causes possibles

    		 Solutions

    Interactions avec les groupes silanol dans le cas des analytes basiques

    • Réduire la valeur du pH de la phase mobile (pH 2-3)

    • Augmentation de la force ionique des éluants

    • Changement pour une colonne de séparation inerte

    • Utilisation de réactifs de paires d'ions

    Volume mort
    • Remballer la colonne si possible
    • Remplacer la colonne

    Vieillissement du matériau d'emballage dû à des températures trop élevées
    • Remplacer la colonne

    Précolonne ou fritté d'entrée de la colonne bloqué(e)

    • Procéder au rétro-rinçage de la colonne (si autorisé)

    • Remplacer la colonne

    Erreur de pH de la phase mobile
    • Ajuster le pH sur la phase stationnaire et les analytes

    Analyte co-élué

    • Optimisation de la préparation des échantillons

    • Optimisation des paramètres de méthodes

    • Optimisation de phase mobile ou stationnaire

    Contamination de la phase stationnaire

    • Utilisation d’une colonne plus longue

    • Laver la colonne avec un solvant puissant

    • Consulter les propositions du fabricant pour régénérer la colonne

    • Procéder au rétro-rinçage de la colonne (si autorisé)

    • Remplacer la colonne
    2.3 Doubles pics

    Doubles pics

    Causes possibles

    		 Solutions

    Avant-colonne ou fritté d'entrée de la colonne bloqué(e)             

    • Procéder au rétro-rinçage de la colonne (si autorisé)

    • Remplacer la colonne

    Surcharge de la colonne

    • Réduire le volume d’injection ou la concentration de l’échantillon

    • Utilisation d’une colonne avec un plus grand

    Solvant d'injection inapproprié

    • Injection dans un solvant plus faible

    • Ajuster le pH du solvant à celui de l'éluant

    • Utiliser un éluant plus fort

    Volume mort

    • Emballez de nouveau la colonne si possible

    • Remplacer la colonne

    Élution d'un deuxième composant d'échantillon

    • Optimisation de la préparation des échantillons

    • Optimisation des paramètres de méthodes

    • Optimisation de phase mobile ou stationnaire

    • Utilisation d’une colonne plus longue

    Report de la dernière analyse

    • Nettoyage de la colonne et du système

    • Utilisation de la phase stationnaire inerte et de hardware de colonne inerte
    3. Temps de rétention et résolution

    Temps de rétention et résolution

    Une modification des temps de rétention et de la résolution va souvent de paire avec une modification de la symétrie des pics et de l'efficacité. Ces symptômes font partie du vieillissement normal de la colonne de séparation, mais ils peuvent également être dus à des fuites dans le système, des problèmes avec l'injecteur, une température instable et une contamination ou un altération de la phase stationnaire du fait de paramètres de méthode inadaptés.

     

    3.1 Le temps de rétention est raccourci

    Le temps de rétention est raccourci

    Cause possible

    		 Solutions

    Surcharge de colonnes (avec des signaux trop hauts/larges)

    • Réduction du volume d'injection

    • Ou dilution plus importante de l'échantillon

    • Choisir un plus grand diamètre intérieur

    Phase de vieillissement/phase altérée par des conditions rudes

    • Travailler selon les spécifications décrites

    • Remplacer la colonne

    • Travailler en continu à la limite des spécifications réduit la durée de vie de votre colonne

    Contamination de la colonne
    • Procéder au rétro-rinçage de la colonne (si autorisé)

    Débit supérieur
    • Débit de contrôle

    Pour les phases non stables à l’eau dans les éluants très aqueux : Mauvaise hydratation de la phase

    • Utiliser des phases spéciales stables à l’eau

    • Longue équilibration des phases conventionnelles

     

    Le temps de rétention est rallongé

    Causes possibles Solutions

    Modification de la composition de l'éluant

    • Vérifier le système de mélange

    • Couvrir les contenants de réserve pour ne pas que les composants s'évaporent

    Débit réduit
    • Vérifier le réglage du débit
    3.2 Modification du temps de rétention

    Décalage du temps de rétention dans un sens

    Causes possibles

    		 Solution

    Fuite du joint d’étanchéité de la pompe
    • Remplacer le joint d’étanchéité de la pompe

    Surcharge de la colonne
    • Laisser une concentration/quantité plus faible

    Équilibration insuffisante
    • Équilibrer/rincer avec 10 volumes de colonne

    Temps de rétention fluctuant / déplacement arbitraire

    Causes possibles Solution

    Température fluctuante

    • Assurer une température constante

    • Pour obtenir des résultats optimums, préchauffer également la phase mobile

    Mélange de solvants insuffisant

    • Vérifier le système de gradients

    • Si nécessaire, utiliser un préchauffage (chambre de mélange)

    Concentration tampon ou valeur pH incorrecte

    • Vérifier la valeur du pH

    • Si nécessaire, préparer un nouveau tampon

    Équilibration insuffisante
    • Équilibrer/rincer avec 10 volumes de colonne

    D’un système à l’autre : Différence dans le temps de séjour         
    • répéter sur le système initial avec les conditions d'origine

    Fuites
    • Rechercher les fuites et les colmater

    Valve défectueuse sur la pompe
    • Vérifier les valves et les remplacer si nécessaire

    Air dans la pompe, air dans la phase mobile

    • Dégazer

    • Si nécessaire, remplacez le joint d’étanchéité
    3.3 Perte de la résolution

    Perte de la résolution

    Mögliche Ursachen Lösung

    Phase mobile contaminée

    • Recommencer la phase mobile (changer régulièrement pour éviter la contamination)

    Précolonne bloquée
    • Changer la précolonne (en cas de modification de la rétention/dissolution, changer la précolonne plus tôt pour éviter la contamination de la colonne principale)

    Vieillissement de la phase

    • Le rinçage régulier et le travail conforme aux spécifications évite le vieillissement prématuré

    • Changer de colonne
    4. Modifications de la ligne de base et récupération des pics

    Changements de lignes de base et récupération de pics

    Des lignes de base qui dérivent ou qui sont bruyantes peuvent compliquer l’intégration des pics et réduire le rapport signal/bruit et, de ce fait, la sensibilité de la méthode.

    Les causes les plus fréquentes se situent dans les composants et les réglages des détecteurs utilisés ou dans une modification des éluants. Elles sont de ce fait relativement faciles à solutionner.

    Mais même une phase stationnaire inadaptée ou un hardware de colonne inadapté peut entraîner la perte des signaux ou des pics fantômes et des reports.

     

    4.1 Pointes

    Spikes

    Causes possibles Solution

    Bulles d’air dans la phase mobile

    • Dégazage de la phase mobile

    • Vérifier le dégazeur dans le système

    • Vérifiez l’étanchéité des raccordements

    Air dans la colonne
    • Veiller à toujours stocker les colonnes fermées
    4.2 Dérive vers un signal plus élevé

    Dérive vers un signal plus élevé

    Causes possibles Solution

    Enrichissement et élution des impuretés

    • Optimiser la préparation des échantillons

    • Utiliser des solvants de qualité HPLC

    • Nettoyage de la colonne

    Viscosité de la phase mobile trop élevée

    • Utiliser des solvants à faible viscosité

    • Augmenter la température de la colonne

    Pour les gradients : l'augmentation du composant B indique une forte absorption des UV
    • Utiliser des solvants qui n'absorbent pas/peu les UV

    Dérive vers un signal inférieur

    Causes possibles Solution

    Pour les gradients : la diminution du composant A indique une forte absorption des UV
    • Utiliser des solvants qui n'absorbent pas/peu les UV
    4.3 Bruit ou pics négatifs

    Bruits

    Causes possibles Solution

    Avec ondulations : Variations de la température dans le local
    • Veiller à assurer une température ambiante constante (four à colonne, isolation de la colonne)

    Bruit continu : Lampe du détecteur défectueuse ou cellule du détecteur sale

    • Remplacer la lampe

    • Nettoyer la cellule

    Bruit régulier : Pompe

    • Nettoyer la pompe

    • Purger l'air de la pompe

    Bruit aléatoire : Impuretés

    • Optimiser la préparation des échantillons

    • Nettoyage de la colonne

    • Utiliser des solvants de qualité HPLC

    Pointes : Air dans le détecteur, les éluants ou la pompe

    • Veiller à ce qu’il n’y ait pas de bulles d'air

    • Purger l'air

    Pic négatif

    Causes possibles Solution

    Détecteur RI : L'indice de réfraction des analytes est inférieur à celui de la phase mobile
    • Inversion de la polarité du détecteur

    Détecteur UV : L'absorption de la phase mobile est supérieure à celle de l'analyte
    • Adaptation de phase mobile
    4.4 Les surfaces de pics sont réduites

    Les surfaces de pics sont réduites

    Causes possibles Solution

    Perte d'échantillon due à une fuite au niveau de l'injecteur, des capillaires ou des raccords vissés
    • Vérifier les composants de l'injecteur (valve et pointeau) Vérifier les raccords vissés et les capillaires et les remplacer si nécessaire

    Intensité de mesure réduite du détecteur en raison d'une cellule à circulation contaminée ou abîmée/d'une lampe UV trop vieille

    • Nettoyer la cellule à circulation

    • Vérifier et remplacer la lampe

    Volume d'injection trop faible
    • Adapter le volume d'injection

    L'éluant présente une absorption trop élevée
    • Utiliser des éluants de qualité HPLC

    Saletés sur le détecteur
    • Nettoyer le détecteur
    4.5 Pics fantômes

    Pics fantômes

    Régénération de colonne

    Les dépôts sur la phase stationnaire sont bien souvent la cause de l’altération des performances de la colonne. Ce qui s’exprime surtout par

    • une contre-pression supérieure,
    • des temps de rétention décalés ou
    • des pics déformés.

    Pour éviter les dépôts, il est recommandé d’utiliser des précolonnes et de procéder à une préparation appropriée des échantillons, par exemple la filtration.
    Les étapes de rinçage sont une mesure efficace pour régénérer la colonne tant à titre de précaution que s'il y a déjà eu adsorption du matériau sur la phase stationnaire. Le rinçage doit toujours être effectué dans le sens contraire du flux, car la contamination se situe en général encore à l'entrée de la colonne et peut ainsi être évacuée plus facilement. Pour un volume de rinçage suffisant, un minimum de 20 volumes de colonne avec un solvant adapté est recommandé.

    Lors du choix des solvants, les caractéristiques de la contamination et la stabilité de la colonne doivent être prises en compte. Le récapitulatif suivant présente les solvants qui conviennent en fonction de différents types d'impuretés. L'efficacité du nettoyage peut être augmentée en élevant la température.

    La température peut être 40 °C - 90 °C selon le solvant employé et en tenant compte de la stabilité de la phase stationnaire. Les instructions du fabricant de la colonne, telles que les instructions d'entretien et d'utilisation, peuvent donner d’autres recommandations.

     

    Contamination par diverses substances

    Contamination
    Sels
    Substances non polaires
    Substances polaires
    Protéines
    Approche

    • Eau et solutions organiques aqueuses
    • Acétonitrile
    • Isopropanol
    • Tétrahydrofurane
    • Dichlorométhane
    • Chloroforme

    • Eau et solutions organiques aqueuses

    • Méthanol

    • Tétrahydrofurane

    • Injection de diméthylsulfoxyde

    • Gradient de 10 % à 90 % B avec A = 0,1 % TFA dans l'eau et B = 0,1% TFA dans l'acétonitrile

     

    Mesures préventives

    D’une manière générale :

    • Rincer régulièrement le système, la colonne et l'injecteur
    • Changer régulièrement les pièces d'usure telles que les filtres, les frittés et les joints d’étanchéité

    pour éviter la contamination.

    En outre, tenir un journal sur les colonnes peut largement faciliter la recherche d’erreur. Nous recommandons de noter, en plus de l'identité de la colonne utilisée, du nombre d'injections et de la contre-pression qui en résulte, également les analytes et méthodes utilisés et d'évaluer régulièrement, à l’aide d’une méthode de tests, la qualité de la colonne de séparation selon les résultats obtenus.

    Il conviendrait également d’établir des notes mettant en évidence les changements dans les éluants, les erreurs dans le système ou autres anomalies. Cela permet d’effectuer en quelques minutes seulement une recherche d’erreurs qui pourrait prendre des jours ou des semaines et, en outre, vous pouvez suivre le gain de productivité après une optimisation des paramètres de votre méthode.

     

    Utilisation d'une précolonne

    L’utilisation d’une précolonne protège la colonne principale de la contamination par le fait que cette dernière est déjà adsorbé sur la précolonne.

    Ce qui évite :

    • La vieillissement prématuré de la colonne de séparation
    • Le décalage du temps de rétention
    • La déformation des pics, etc.
    • Le volume mort dans la phase stationnaire du fait des impulsions de pression

    Les précolonnes doivent être changées régulièrement, par exemple lorsque la pression augmente.

    Une méthode de test générale permet d’enregistrer la résolution, la symétrie des pics et la contre-pression et de contrôler le statut de la colonne et de la précolonne.

    Liaison sans volume mort

    Les volumes morts entraînent un élargissement des bandes, surtout dans les applications UHPLC. Pour éviter les pics larges, on peut utiliser des connecteurs universels sans volume mort comme le. En outre, tous les capillaires du système doivent être aussi courts que possible.

    Les volumes morts entraînent notamment dans les applications UHPLC un élargissement de la bande. Pour éviter les larges pics, il est possible d'utiliser des connecteurs universels sans volume mort tels que le MarvelXACT. Par ailleurs, tous les capillaires du système doivent être maintenus aussi courts que possible.

     

    Filtrer l'échantillon et les éluants

    L'échantillon et les éluants doivent être filtrés avant utilisation par un pore de 0,45 μm (particules > 3 μm) ou 0,2 μm (particules ≤ 3 μm). Protection contre:

    • Bloquer le fritté
    • Contamination de la phase stationnaire par des particules
    • Division des pics
    • Fronting
    • Tailing
    • Contre-pression supérieure
    Changer régulièrement les éluants

    Le vieillissement des éluants (ex : biocroissance en phase aqueuse, polymérisation d’un acétonitrile pur) peut contaminer le système.

    Changer la phase mobile aqueuse :

    HPLC : au bout de 1 semaine maximum
    UHPLC : au bout de 3 jours maximum

    L'air peut être emprisonné dans les éluants, ce qui peut entraîner des variations du temps de rétention.

    C’est pourquoi les éluants doivent toujours être dégazés :

    • En lavant l'air à l'hélium (une fois par jour)
    • Dégazeur sous vide en ligne
    Accorder l'échantillon de solvant à la phase mobile

    Le solvant de l'échantillon peut avoir une forte influence sur la séparation, c'est pourquoi il faut veiller à :

    • Utiliser des solvants faibles pour l'échantillon ➔ sinon fronting avant picss
    • viter les différences importantes de pH entre l'échantillon et l'éluant ➔ sinon division des pics

    Equilibrage suffisant

    Lors de l’équilibrage et du rinçage d’une colonne, se pose fréquemment la question suivante :
    Combien de temps la colonne doit-elle être rincée ?
    Si le temps de (ré)équilibrage est trop court, il y a risque de résultats non reproductibles, par exemple du fait d’un décalage du temps de rétention. En cas de doute, il vaut mieux utiliser des temps de rinçage plus longs.

    Un exemple pratique :

    Une colonne YMC-Triart C8 (volume de la colonne 2,5 ml) a été rincée avec 50 ml d'acétonitrile à 100 % avant chaque cycle de test. Un extrait de plante a été injecté dans différentes conditions : Sans équilibrage préalable, équilibrage avec 1 volume de colonne, 5 volumes de colonne (résultat escompté) et avec 10 volumes de colonne. L'équilibrage et la séparation isocratique ont été réalisés avec l'éluant : Eau/acétonitrile (80/20). [Le volume Dwell de l’installation était de 130 μL.]

    On voit clairement que sans équilibrage suffisant, les temps de rétention sont nettement décalés. Si on équilibre avec 5 volumes de colonne (SV) ou 10 SV, les résultats de cette application sont reproductibles.

    Estimation du temps de rinçage optimal

    Comment estimer le temps de rinçage optimal ?
    ➔À l'aide du volume de la colonne !

    Le volume géométrique de la colonne est un moyen très utile pour estimer le volume de solvant nécessaire pour les étapes de rinçage et d'équilibrage de la HPLC - une condition préalable importante pour obtenir des résultats reproductibles et valides.

    Calcul du volume de la colonne

    Colonne :                    YMC-Triart C18
    Dimension de la colonne :   250 x 4.6 mm ID
    Volume de la colonne [mL]  = 25 cm × (0.23 cm)2 × 3.14
                                    = 4.2 cm3

    À quoi d’autre faut-il veiller ?

    Volume Dwell
    • Volume du système avant que le solvant atteigne la colonne
    • En fonction du système (demandez à votre fabricant)

    Volume de la phase stationnaire
    • Calculer le facteur de correction (0,6-0,8).
    • Selon la phase stationnaire et la densité de l’emballage

    Aperçu des volumes géométriques de colonnes [ml] pour les dimensions de colonnes sélectionnées

    Documents techniques

    Titre Type de document Langue Télécharger
    BrochureYMC (U)HPLC Troubleshooting Guide Brochure EN
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    BrochureYMC (U)HPLC Troubleshooting Handbuch Brochure DE
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    Expert Tip(U)HPLC Method Parameter Quick Reference Expert Tip EN
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    Expert Tip(U)HPLC Methodenparameter Kurzübersicht Expert Tip DE
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    Expert TipA hidden cause for peak tailing of small acidic compounds Expert Tip EN
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    Expert TipEasy solution for distorted peaks in HPLC methods of the European Pharmacopoeia (Ph. Eur.) Expert Tip EN
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    Expert TipEine versteckte Ursache für Peak Tailing in der (U)HPLC-Analytik saurer Verbindungen Expert Tip DE
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    Expert TipEinfache Lösung für gestörte Peakformen in HPLC Methoden der Europäischen Pharmakopöe (Ph. Eur.) Expert Tip DE
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    Expert TipEquilibration – As much as necessary, as little as possible Expert Tip EN
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    Expert TipExpert tip: Column regeneration Expert Tip EN
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    Expert TipExpertentipp: Säulenregeneration Expert Tip DE
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    Expert TipGuideline to buffer selection for RP methods Expert Tip EN
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    Expert TipHow to improve the analysis of hydrophobic compounds Expert Tip EN
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    Expert TipIs your sample soluble in your mobile phase? Expert Tip EN
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    Expert TipIssues with basic analytes Expert Tip EN
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    Expert TipIst Ihre Probe in Ihrer mobilen Phase löslich? Expert Tip DE
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    Expert TipMinimising carryover in oligonucleotide analysis by AEX Expert Tip EN
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    Expert TipÄquilibration – So viel wie nötig, so wenig wie möglich Expert Tip DE
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    OverviewOverview on YMC-Hardware Types in Combination with YMC-Phases Overview EN
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    PosterThe Principles of BioLC & YMC BioLC Phase Overview Poster EN
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    PosterThe Principles of Liquid Chromatography Poster EN
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    Technical NoteAllowable Adjustments to HPLC Methods in the European Pharmacopoeia (Ph.Eur.) Technical Note EN
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    Technical NoteErlaubte Änderungen in HPLC Methoden aus der Europäischen Pharmakopöe (Ph.Eur.) 11. Edition Technical Note DE
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    Technical NoteUHPLC systems compatible with 1 mm ID columns Technical Note EN
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